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支原體檢測試劑盒qPCR Kit (經(jīng)典法)的操作步驟

更新時間:2022-11-23  |  點(diǎn)擊率:1055

支原體qPCR法介紹:

熒光定量PCR法(qPCR):是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記,使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光,利用熒光信號的變化和配套軟件,進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時監(jiān)測,簡稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn):

①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時間短,2-3小時出結(jié)果

③檢測結(jié)果可定量

④操作簡便

缺點(diǎn):

①對于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。(可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證)

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大(由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同),需謹(jǐn)慎選擇,盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

操作步驟

第1步:樣本處理

a.細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明:①樣品基質(zhì)可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原DNA,影響檢測靈敏度。

建議:樣本做DNA抽提處理,實(shí)現(xiàn)最高靈敏度。

推薦:德國MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒

Venor® Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過廣泛驗(yàn)證。

第2步:試劑制備

a.凍干粉溶解

b. 反應(yīng)體系制備

b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備

b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備

第3步:啟動熒光定量PCR儀

第4步:結(jié)果判別

FAM通道:檢測支原體熒光信號。HEX通道:檢測內(nèi)控對照熒光信號。

支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號的競爭性抑制。

支原體DNA越多,F(xiàn)AM通道信號越高,檢測內(nèi)控對照的HEX通道信號越低。

定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ct<40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果


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