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細(xì)胞培養(yǎng)的基本步驟有哪些?

更新時(shí)間:2022-08-10  |  點(diǎn)擊率:683

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)指的是細(xì)胞在體外條件下的生長(zhǎng),在培養(yǎng)的過(guò)程中細(xì)胞不再形成組織(動(dòng)物)。培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)都要生活在人工環(huán)境中,由于環(huán)境的改變,細(xì)胞的移動(dòng)或受一些其他因素的影響,培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng),傳代導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)單一化型。

一、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)2113胞從液氮5261中取出后,在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融4102化。移人15ml離心管中,加入10ml預(yù)熱1653的DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。

加入10mlDMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10mlDMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤(pán)中,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí).去培養(yǎng)基,10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

加入10mlPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán),轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10mlPBS(經(jīng)高壓滅菌,保存于40C),吹勻,吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù),按照1×106/盤(pán)接種,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí),去培養(yǎng)基,10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán),轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。

加入lml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(nèi)(盒內(nèi)有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80℃冰箱內(nèi),過(guò)夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個(gè)月。

凍存液的配制:70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,邊滴邊搖。

科研實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞要養(yǎng)好,就要用好血清,如Ausbian®特級(jí)胎牛血清,它適合各種細(xì)胞培養(yǎng),尤其適合難養(yǎng)細(xì)胞,如:干細(xì)胞、肝細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞,原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染細(xì)胞等


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