PCR實驗的污染來源都有：樣本間交叉污染、實驗試劑污染、擴(kuò)增產(chǎn)物污染

防止實驗污染都有哪些措施？

對于低流行地區(qū)，PCR檢測人員經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)上崗后，核酸污染的風(fēng)險相對較小，但在疫區(qū)超負(fù)荷工作時，就可能會遇到核酸污染的問題，可通過以下措施降低污染機(jī)會：

正確佩戴手套：手套未緊密貼合拇指、食指和中指，在進(jìn)行開蓋操作時容易發(fā)生交叉污染。

正確使用生物安全柜：簡單、整潔、避免通風(fēng)口堵塞；操作前后紫外線照射，消毒劑隨手可及；廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液，并且及時清理廢液缸，保證廢物不超過廢液缸體積的2/3。

核酸提取儀去污染：每天多批次檢測時，在每一批次檢測完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對儀器進(jìn)行去污染。

重視通風(fēng)：不定期對房間進(jìn)行通風(fēng)，每次至少持續(xù)30min。

PCR擴(kuò)增區(qū)去污染：PCR反應(yīng)管必須蓋緊，避免擴(kuò)增后的核酸對環(huán)境的污染。

實驗室隨手可及的消毒劑。

• 常規(guī)PCR Kit （經(jīng)典法）(不含Taq酶）

特點

1.內(nèi)控對照為獨立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

2.高特異性，僅一條陽性對照條帶，即可涵蓋所有可能感染細(xì)胞的支原體物種。操作簡單，

易于觀察。

3. 高靈敏度，若PCR反應(yīng)體系加入10μl樣本，支原體檢測限度為≤5或≤10CFU。

(詳見下文“(2)Venor® Gem Classic Kit 10種常見支原體檢測限“)

4.歐洲藥典要求的26種支原體均可檢出。該試劑盒可檢測出1種脲原體、7種無膽甾原體和85種支原體，與細(xì)菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

5.試劑盒中不含Taq酶，可另外購買。推薦使用德國MB公司專用Taq酶。(貨號: 53-1050)

Venor® Gem Classic Kit

10種常見支原體檢測限

操作步驟

第1步：樣本處理

a. 細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明：①樣品基質(zhì)可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理，實現(xiàn)最高靈敏度。

推薦：德國MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒，Venor® Gem Sample Preparation Kit。該DNA抽提試 劑盒已經(jīng)過廣泛驗證。

第2步：試劑制備

第3步：PCR體系建立

a. 細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

第4步：啟動PCR反應(yīng)

第5步：電泳結(jié)果分析

191bp為內(nèi)控對照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。

當(dāng)樣本存在支原體污染時，由于內(nèi)控對照與支原體DNA存在競爭，內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ɡ缰гwDNA＞103拷貝）。

陽性對照中支原體DNA＞104拷貝，內(nèi)控對照條帶會*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結(jié)果。

如果待測樣本對PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ê完幮詫φ障啾龋?，此時應(yīng)先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒，詳見第25頁），然后再檢測。

儲存條件

2~8℃至少6個月。復(fù)溶后在-18℃保存。