生物制品和細(xì)胞治療企業(yè)已越來(lái)越多地采用核酸法進(jìn)行支原體的檢查和生產(chǎn)質(zhì)控。核酸法如替代藥典方法，則需進(jìn)行方法驗(yàn)證。

現(xiàn)在一些地方在使用德國(guó)MB公司的支原體標(biāo)準(zhǔn)品或支原體基因組DNA（定量標(biāo)準(zhǔn)品），包括靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品（10CFU,100CFU）、特異性標(biāo)準(zhǔn)品以及PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品，其中靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品也可用于耐用性的驗(yàn)證。

MB廠家具有ISO 9001和ISO 13485質(zhì)量體系認(rèn)證。每個(gè)批次支原體標(biāo)準(zhǔn)品都有驗(yàn)證和質(zhì)控。同時(shí)支原體培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基每個(gè)批次都符合歐洲藥品質(zhì)量管理局（EDQM）的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)品每個(gè)批次都提供有質(zhì)控證書（COA）。標(biāo)準(zhǔn)品所用的支原體菌株來(lái)自英國(guó)NCTC菌種保藏中心，同時(shí)具有相應(yīng)的ATCC編號(hào)。

下面對(duì)MB廠家的三類標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)控方面做一介紹。

（一）支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品

10CFU™支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品為滅活支原體，這樣不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成支原體污染。它用于核酸法的靈敏度和耐用性驗(yàn)證。它每盒含3管10CFU支原體凍干粉，2管陰性對(duì)照。靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品主要經(jīng)過(guò)下列三方面的質(zhì)控：

1. 功能檢測(cè)：

即標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后作DNA抽提（采用MB公司的Venor®GeM Sample Preparation Kit），再用符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的qPCR試劑盒檢測(cè)，應(yīng)保證有擴(kuò)增曲線。

2. 活力檢測(cè)：

即標(biāo)準(zhǔn)品在培養(yǎng)基中復(fù)溶并培養(yǎng)7天后，再進(jìn)行DNA抽提和qPCR檢測(cè)，Ct值和對(duì)照組比，應(yīng)不超過(guò)允許閾值（ΔCt >2）。該檢測(cè)主要是確保支原體均已滅活。

3.di閾限檢測(cè)和批次合格標(biāo)準(zhǔn)：

標(biāo)準(zhǔn)品用DMEM+5%FCS進(jìn)行10倍梯度稀釋，形成3個(gè)稀釋度，DNA抽提后然后進(jìn)行前后3輪qPCR檢測(cè)，每輪每個(gè)稀釋度重復(fù)8次。每種支原體的Ct平均值應(yīng)達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)，方為合格。

（二）支原體基因組DNA——特異性驗(yàn)證用

該基因組DNA是從相應(yīng)的支原體中抽提出來(lái)，并制成凍干粉。每管為10ng左右。復(fù)溶時(shí)，每管加100ml廠家提供的Tris緩沖液，室溫靜置5分鐘，再渦旋離心5秒鐘。

廠家對(duì)基因組中的16S rRNA段進(jìn)行了序列分析，要求應(yīng)與相應(yīng)支原體物種的同源性應(yīng)達(dá)到99%以上。對(duì)制備的DNA質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行了熒光分析和PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增應(yīng)顯示為單一的擴(kuò)增條帶。

（三）PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品

每管為1x108拷貝的支原體物種基因組DNA凍干粉，使用時(shí)也是先用廠家提供的Tris緩沖液復(fù)溶。質(zhì)控時(shí)，對(duì)16S rRNA的部分序列進(jìn)行測(cè)序分析，以鑒定支原體物種，測(cè)序結(jié)果應(yīng)顯示為99%以上的同源性。再對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)品作系列梯度稀釋，再進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，應(yīng)顯示為良好的線性。該方法還可確定qPCR方法的檢測(cè)閾值。

MB公司的上述三類標(biāo)準(zhǔn)品可用于對(duì)支原體核酸法的方法學(xué)驗(yàn)證，包括靈敏度、特異性和耐用性。其中，基因組DNA除了包括常見(jiàn)支原體物種外，還包括一些常見(jiàn)細(xì)菌，用于驗(yàn)證常規(guī)PCR或qPCR的檢測(cè)是否會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

總之，良好的質(zhì)控是標(biāo)準(zhǔn)品品質(zhì)的保證，這樣才能確保方法驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，使支原體的核酸法檢測(cè)符合藥典所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，從而為替代培養(yǎng)法等經(jīng)典支原體的檢測(cè)方法提供數(shù)據(jù)支持。

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